原代細胞的復蘇步驟

　　細胞一般儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。

　　細胞復蘇就是要把原本冷凍保存(凍存)著的細胞恢復到一般的生長狀態，今天我們來看看原代細胞的復蘇步驟。

　　一、檢查

　　收到細胞株包裹時，請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請立即處理告訴寄方。細胞株請盡速開始培養，或立即冷凍保存(置于–70 °C，隔夜后，移到液氮罐保存)。

　　二、冷凍細胞解凍　

     方法一：

1、準備好37度水浴鍋，預熱至37度；

2、準備好T25培養瓶，加入10ml完全培養基（培養基量必須大于凍存液10倍體積）；

3、取出凍存細胞管，用一次性PE手套包裹凍存管（防止管內進水導致污染），迅速放于水浴鍋內，于1min內融化完全；

4、取出凍存管，酒精噴灑消毒后擦干，置于超凈臺內；

5、吸取凍存管內細胞懸液，加入步驟2中準備好的T25培養瓶內，8字緩慢搖勻；

6、培養瓶放于37度CO₂恒溫培養箱內，靜置培養24h，更換新鮮換培養基（注意貼壁細胞、懸浮細胞不同操作方法）。

     方法二：

1、準備好37度水浴鍋，預熱至37度；

2、準備好15ml無菌離心管，加入10ml完全培養基（培養基量必須大于凍存液10倍體積）；

3、準備好實驗用培養板或培養器皿；

4、取出凍存細胞管，用PE手套包裹凍存管（防止管內進水導致污染），迅速放于水浴鍋內，于1min內融化完全；

5、取出凍存管，酒精噴灑消毒后擦干，置于超凈臺內；

6、吸取凍存管內細胞懸液，加入步驟2中準備好的15ml無菌離心管，輕輕吹打混勻；

7、將離心管內細胞懸液，按實驗需求接種于實驗器皿內（注意接種密度不低于2×10⁴/cm²），放于37度CO2恒溫培養箱內，靜置培養24h，更換新鮮換培養基（注意貼壁細胞、懸浮細胞不同操作方法）?！　?/span>

　　三、細胞復蘇注意事項

1、整個復蘇過程要盡量快，溶解時間太長可能影響復蘇效果；

2、已溶解的凍存細胞盡量短時間的在常溫存放，盡快稀釋或者離心去除DMSO；

　　3、由于“化冰”這一步里凍存管與水溫差太大，尤其是液氮里拿出來的凍存管，放到水里可能會造成翻江倒海的既視感，所以可以用鑷子夾住凍存管往水里摁，這樣即使有炸裂的情況也會有水做緩沖；

　　4、取凍存管時要謹防凍傷，尤其是夏天，盡管熱也最好穿長袖白大褂；

　　5、離心這一步也可以在凍存管里的冰融化后直接進行，也就是直接把凍存管離心，離心后棄去原來的凍存液，然后直接加完全培養基重懸細胞，接著把細胞轉到培養皿/瓶里培養。這種方法也許不能將DMSO清除得很干凈，但是基本影響不大；

　　6、 復蘇第二天記得去看看細胞，如果狀態還不錯的話就說明復蘇成功。