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      細胞的凍存與復蘇

      來源:Pricella  瀏覽量:  發布時間:2021-10-28 10:48:24


      一、   程序凍存步驟(需梯度降溫)

      1、 配置凍存液,凍存液推薦配比:55%(基礎培養基)+40%(血清)+5%(DMSO)或90%胎牛血清+10%DMSO;推薦使用Procell通用血清型程序凍存液,貨號PB180436;

      2、 制備好的細胞懸液計數,計算總細胞量;

      3、 細胞離心后盡量吸干凈上清,離心轉速1200rpm(250g)3min;

      4、 加入配置好的凍存液重懸,調整細胞濃度為3×106~1×107cells/mL;

      5、 分裝入凍存管,一個凍存管分裝1~1.5毫升;

      6、 推薦使用程序降溫盒,分裝好的凍存管轉入程序降溫盒后直接放入-80℃冰箱過夜;

      7、 如沒有程序降溫盒,則按下列順序依次降溫:室溫→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃過夜→液氮保存,注意轉移過程中要保冷,避免產生溫差或凍存管融化;

      8、 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉移到液氮長期保存。

       

      注意事項:

      1、 DMSO配制的時候會放熱,一定要等凍存液冷卻后使用,避免灼傷細胞;

      2、 細胞離心后盡量吸干凈上清液,減少培養基殘留,避免稀釋凍存液;

      3、 不建議手動梯度降溫,溫度不穩定,容易降低存活率;

      4、 注意程序降溫盒內異丙醇的量必須高于最低刻度線;凍存5次后異丙醇需要更換一次,以免影響凍存效果;程序降溫盒需恢復到室溫以后才能繼續使用,不能從冰箱拿出來直接使用;

      5、 細胞懸液加入凍存液以后盡量短時間的在常溫放置,DMSO常溫下對細胞損傷大,分裝完成后立即轉入程序降溫盒放到-80度冰箱,不需要放4度;

      6、 -80度凍存過夜后可以轉入液氮長期保存,轉入液氮的過程需要對凍存盒進行保冷,不要長時間在常溫暴露,避免凍存管融化;

      7、 若沒有液氮罐,存放在-80度的時候一定要放靠里面的位置,避免開關冰箱導致溫度不穩定。

      8、 細胞凍存后應取出一管復蘇,檢測細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內長期保存,為穩妥起見可在細胞凍存半年后復蘇培養,觀察細胞生長情況,再繼續凍存;

       

      二、   非程序凍存步驟(需使用無血清凍存液)

      1、  凍存液叢冰箱提前拿出回溫到室溫,推薦Procell無血清非程序凍存液,貨號PB180438;

      2、  制備好的細胞懸液計數,計算總細胞量;

      3、  細胞離心后盡量吸干凈上清,離心轉速1200rpm(250g)3min;

      4、  加入無血清非程序凍存液(PB180438)重懸,調整細胞濃度為3×106~1×107cells/mL;

      5、  分裝入凍存管,一個凍存管分裝1~1.5毫升;

      6、  分裝好的凍存管直接轉入-80度冰箱過夜,不需要程序降溫盒;

      7、  轉入液氮途中需將凍存管做好保冷措施,避免直接暴露于常溫,快速轉入液氮罐進行長期保存;

       

      注意事項:

      1、 由于沒有使用凍存盒,在轉入液氮的過程中一定要對凍存管做好保冷措施,不能直接用手拿,可以用干冰或者少量液氮保護后轉移,操作過程注意安全;

      2、 轉移過程要快,避免凍存管暴露于常溫后融化;

      3、 若沒有液氮罐,存放在-80度冰箱的時候一定要放靠里面的位置,避免開關冰箱導致溫度不穩定;

       

      三、   細胞復蘇步驟

      1、  將水浴鍋預熱至37℃,準備好干凈的一次性PE手套,一個無菌離心管內加入9ml無菌培養基;

      2、  將細胞從液氮罐中取出放入PE手套中,迅速沒入水浴鍋,搖晃凍存管加速溶解,以1分鐘內全部溶解為宜;

      3、  在超凈臺中將復蘇好的細胞液加入到裝有新鮮培養基的離心管內,1200rpm/min 離心3分鐘,離心完畢去掉上清;

      4、  用適量與細胞對映的完全培養基重懸細胞,接入到無菌容器中(培養瓶或培養皿),補充培養基到適宜,放入培養箱培養;

       

      注意事項:

      1、 水浴鍋的位置如果與液氮罐不是一個房間,需要對凍存管進行保冷后轉移到水浴鍋旁,避免路途細胞表面融化;

      2、 細胞溶解過程快速搖晃以加速溶解;

      3、 已溶解的凍存細胞盡量短時間的在常溫存放,盡快離心去除DMSO;

      4、 貼壁細胞復蘇24小時后觀察,若密度達到80%,則正常傳代;若密度不到80%則繼續培養到48小時再換液;

      5、 懸浮細胞復蘇3天內不建議離心換液;

      6、 對DMSO不敏感的細胞在復蘇時也可不離心,減少操作步驟,也可降低污染的幾率。將解凍的細胞懸液直接轉移至T25細胞瓶內,補加新鮮培養基,放入溫箱內培養。但培養12~24h后必須換新鮮的培養基,移除死細胞。


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